文献速递第期结合射频消融的局部

大家早安，今天的文献速递内容是对昨天文献的结果部分的详细介绍，虽然阅读和翻译这部分很费力气，也花了很多时间，但我相信对详细理解免疫治疗与局部热消融的联合作用会有很大帮助。

结合射频消融的局部免疫调节导致局部和远处结肠直肠癌的完全治愈-2

结果：

仅RFA治疗并未增加患者结直肠肝转移中的TILs

RFA和局部免疫刺激的组合导致微转移模型中局部和远处小鼠肿瘤的完全治愈

实验小组在图2（a）中描述。由于在RFA和RFA+空凝胶处理之间未观察到显着差异，因此选择RFA+空凝胶作为所有实验的对照组。我们发现单独使用GM-CSF-BCG的凝胶对局部肿瘤的影响很小，而RFA诱导了治疗肿瘤的完全消退（图2（b））。通过生物发光成像可视化远处肿瘤生长的变化（图2（c））。单独RFA空凝胶治疗仅显示对远处肿瘤进展的短暂抑制作用。RFA与GM-CSF和BCG液体溶液结合使用效果不大。相比之下，完全治疗（RFA+Gel-GM-CSF-BCG）在治疗后15天导致完全肿瘤消退。此外，用完全组合治疗的小鼠CD8+T细胞清除（CD8Depletion）完全消除了肿瘤生长的控制（图2（d）），证实治疗效果是由CD8+T细胞介导的。与所有其他组相比，RFA与局部完全组合的小鼠存活率显着提高（图2（e）），小鼠治疗后9个月存活率为50％。

图2.RFA和Gel-GM-CSF-BCG联合疗法改善RFA在模型中的抗肿瘤作用并保持对肿瘤再攻击的免疫力。（a）实验方法：在右侧腹皮下植入Balb/c小鼠CT26-Luc肿瘤块，当肿瘤达到约mm3时，进行RFA（温度高于60℃，2个循环时间），同时将GM-CSF和BCG水凝胶（Gel-IM）注射到治疗的肿瘤中。在小鼠的对侧腹植入远处肿瘤（个CT26-Luc细胞）。（b）：RFA对局部治疗肿瘤的影响。在RFA后每三天用生物发光成像测量肿瘤体积。通过i.p.注射小鼠。使用2mg荧光素的途径和用iCDD照相机在10分钟内进行信号采集（每组n=10）。（C）：在治疗后第3,7,13和21天用生物发光成像显示远处肿瘤生长。（d）：用生物发光监测远处肿瘤生长（n=10）。通过i.p.注射小鼠。使用2mg荧光素的途径和用iCDD照相机在10分钟内进行信号采集（每组n=10）。进行了使用Bonferroni后测试的双向重复测量ANOVA。结果用任意单位表示。（E）：显示了Kaplan-Meier生存曲线。进行秩检验，***P0.。将所有组与对照（RFA+空凝胶）进行比较。（F）：抗肿瘤反应记忆。表现出远处肿瘤完全消退的RFA+Gel-GM-CSF-BCG组小鼠在第0天依次用肿瘤细胞再次攻击，第29天用肿瘤块再次攻击。肿瘤体积每3天通过生物发光测量（n=4）。*P0.05，**P0.01，***P0.。

治愈小鼠的抗肿瘤免疫记忆

为了评估T淋巴细胞的免疫记忆，用CT26-Luc细胞和CT26-Luc块再次攻击显示远处肿瘤完全消退的小鼠。如图2（f）所示，肿瘤细胞注射后未观察到肿瘤生长，并且在肿瘤块植入后观察到快速消退。我们的研究结果表明，RFA联合水凝胶局部免疫刺激诱导了强大的抗肿瘤免疫力，能够消除残存肿瘤和控制肿瘤复发。

联合治疗刺激了远处肿瘤中浸润性T细胞的增加。

既然RFA结合GM-CSF-BCG凝胶有抑制肿瘤生长的能力，我们试图确定CD8+细胞毒性T淋巴细胞，CD4+T辅助淋巴细胞，FoxP3+调节因子T淋巴细胞和CD45RB淋巴细胞的肿瘤内浸润情况。在治疗后第17天取出远处肿瘤，通过免疫组织化学评估TIL。我们通过RFA和局部免疫刺激观察到远处肿瘤中CD3+，CD4+和CD8+T细胞浸润的显著增加。FoxP3表达水平也增强（图3（a，b））。然而，B淋巴细胞在远处肿瘤上的浸润在所有组中相似（图S1）。这些结果表明，用RFA结合Gel-GM-CSF-BCG治疗局部肿瘤在效应T细胞介导的远端肿瘤中诱导持续的免疫应答。

图3.IHC分析显示完全联合治疗可增加TILs。

将未处理的，RFA和RFA+Gel-GM-CSF-BCG组的肿瘤在17天切除并固定用于进一步进行IHC染色CD3，CD4，CD8，FoxP3分析（n=5）。（a）：不同组中肿瘤浸润淋巴细胞的代表性图像。比例尺50μm。（b）：使用宏观图像J定量肿瘤上的淋巴细胞密度。白条表示未处理组，灰条为RFA处理组和黑柱表示接受完全处理的组。采用bonferroni比较试验进行单因素方差分析，*P0.05，**P0.01。

肿瘤内GM-CSF-BCG凝胶注射增加了由RFA诱导的全身特异性T细胞免疫应答

为了确定局部肿瘤免疫调节对全身反应的影响，我们通过流式细胞术分析了脾脏中的CD4+和CD8+T细胞群。未处理的RFA和完整处理组中的细胞百分比之间未发现差异（数据未显示）。

为了研究外周T淋巴细胞的功能，我们分析了脾脏T细胞产生IFN-γ和TNF-α的能力。用作阳性对照的PMA/离子霉素刺激显示所有组中TNF-α和IFN-γ表达增加，证实了T淋巴细胞的特征。我们没有观察到RFA组和对照之间CD4+和CD8+T细胞的两种细胞因子表达的差异。相反，使用组合疗法，T细胞的IFN-γ和TNF-α的表达增加了4倍（图4（a））。

在用加热的CT26-Luc热消融后，完全治疗组中CD4+和CD8+T细胞内的细胞因子表达显着更高（图4（b）），这证明了抗肿瘤免疫应答的特异性。

图4.RFA+Gel-GM-CSF-BCG处理后特异性T细胞应答的诱导。

在处理后第17天，切除未处理（粉红色），RFA（蓝色）和RFA+Gel-GM-CSF-BCG（灰色）组的脾脏（n=5）。将器官解离并将脾细胞收集在新鲜培养基中。对TCD4+和TCD8+分泌的IFN-γ和TNF-α进行流式细胞术分析。（a）：新鲜非刺激脾细胞IFN-γ和TNF-α阳性细胞分析。（b）：2.将CT26-Luc细胞在46℃温育1小时，并与2.个新鲜脾细胞共培养。通过流式细胞术分析由刺激的脾细胞表达的IFN-γ和TNF-α。采用bonferroni比较试验进行单因素方差分析，*P0.05，**P0.01，***P0.。

RFA和局部免疫疗法与抗PD1的结合在远处大转移灶中产生协同抗肿瘤作用。

PD1阻断治疗的疗效与预先存在的T细胞免疫应答有关。正如我们在之前的实验中所显示的，通过联合治疗增加T细胞介导的免疫应答，我们研究了加入抗PD1治疗RFA局部免疫治疗以治疗巨大转移。为此，我们开发了一个大型病变模型并评估了这种关联。

与单独的RFA治疗相比，我们观察到RFA和Gel-GM-CSF-BCG组合的更大效果。全身注射抗PD1增强RFA+Gel-GM-CSF-BCG对远处肿瘤的作用并导致远程肿瘤在大多数小鼠上完全消退（图5（b））。完全治疗对小鼠的存活率也有很大影响，4个月后小鼠存活率为33％（图5（c））

图5.RFA和Gel-GM-CSF-BCG联合治疗改善了宏观转移模型中的PD1反应。

（a）实验方法：将Balb/c小鼠两侧的皮下植入CT26-Luc肿瘤块。用RFA处理局部肿瘤，并通过相同途径注射含有GM-CSF和BCG的水凝胶。在第4,7,10和12天治疗后注射抗PD-次。（b）用卡尺每3天测量远处肿瘤的肿瘤体积，并根据公式计算体积（宽度*宽度*长度/2）。每组n=10。采用Bonferroni后验进行双向重复测量方差分析。（c）Kaplan-Meier生存曲线显示在该图中;进行对数秩检验。所有组均与对照组（RFA+空凝胶）进行比较，ns：无显著性，*P0.05，**P0.01，***P0.

完全组合和抗PD1对浸润肿瘤的淋巴和骨髓细胞的影响

为了评估免疫细胞在不同组小鼠中的参与度，我们分析了小鼠远处肿瘤中CD45+细胞的肿瘤内TILs（定义为CD3+CD4+CD8+）和MDSCs（定义为Ly6-Gr1+CD11b+细胞）。未治疗组与RFA+抗PD1治疗、RFA、RFA-Gel-GM-CSF-BCG组相比，我们观察到完全治疗小鼠远端肿瘤中CD45+免疫细胞增加2倍至20倍。MDSCs分析显示，与其他组相比，完全治疗组小鼠的MDSCsLy6-Gr1+CD11b+细胞浸润肿瘤显着减少；巨噬细胞F4/80细胞和破壁细胞CD11c+CD80+CD86+没有差异；相反，T细胞浸润的特征在于CD8+T细胞比例显着增加，而CD4+T细胞的比例相似。

完整的联合治疗和PD-1检查点抑制剂增强了全身特异性免疫反应

我们接下来评估脾脏中淋巴细胞的组成和活化状态，以探究是否已经诱导了全身性肿瘤抗原特异性T细胞。与未处理组和RFA+抗PD1组相比，我们检测到在完全治疗组中产生TNF-α的CD4+和CD8+T细胞显著增加，且产生IFN-γ的CD8+T细胞显着增加（图7）。

图7.RFA+GM-CSFBCG凝胶与抗PD1的组合增强了肿瘤特异性T细胞应答。

如图5中所述处理小鼠。在处理后第13天，取出所有组（n=5/组）的脾并如图4所述进行处理.CD4+表达的IFN-γ和TNF-α的流式细胞术分析和TCD8+T淋巴细胞进行。（a）未经刺激和刺激的脾细胞分泌的IFN-γ和TNF-α的定量，加热的CT26肿瘤细胞来自未处理（白条），RFA（浅灰条），RFA-Gel-GM-CSF-BCG（深灰色条），RFA+抗PD1（浅灰色阴影框），RFA-Gel-GM-CSF-BCG+抗PD1（深灰色阴影框）组。（b）：通过加热的CT26从未处理的RFA+抗PD1和RFA-Gel-GM-CSF-BCG+抗PD1组覆盖在受刺激的脾细胞上表达的IFN-γ和TNF-α细胞因子的表示。*P0.5，**P0.01

这些数据表明，含有GM-CSF-BCG的热敏水凝胶的原位免疫调节增强了RFA-抗-PD1抗肿瘤反应并诱导了继发性特异性CD8+T细胞免疫应答。

原文：

LemdaniK,MignetN,BoudyV,SeguinJ,OujagirE,BawaO,etal.Localimmunomodulation

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